pg电子游戏pg电子下载:《食品科学》：四川轻化工大学明红梅教授等：酱香白酒第5轮堆积发酵过程菌群演替与有机酸关联分析

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  酱香型白酒作为中国白酒四大基本香型之一，具有酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、回味悠长、空杯留香持久的风格特点，深受消费者喜爱。酱香型白酒采用传统的固态发酵法和“12987”的酿造工艺，在7 次取酒中，第3、4、5次取酒产量最高，且香气结构谐调，酱香突出。其中，经第5轮次堆积和窖池发酵得到的第4次基酒，在成品酱酒勾调中约占25%，对成品酱酒的口感、风格等具备极其重大影响。酱香型白酒发酵包括堆积发酵和窖池发酵两部分，其中堆积发酵是酱香型白酒生产的独特工艺。在堆积发酵时，堆体网罗大量参与糖化、发酵和代谢产生风味物质的微生物，对酱酒生产起关键作用。

  有机酸是酱酒中重要的呈香呈味物质，同时也是酯类物质的前体物质。在酱香型堆积酒醅中的有机酸种类同样丰富，包括乳酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、柠檬酸等，其中含量较高的是乳酸和乙酸。有机酸对微生物群落构成及其演替具备极其重大影响。此外，酒醅微生物还受到淀粉、还原糖等理化因子的调控。

  四川轻化工大学食品与酿酒工程学院的黄俊秋、明红梅*和泸州品创科技有限公司的王松涛等人选取高效液相色谱（HPLC）技术定性定量分析挥发性有机酸中较高含量的乙酸和甲酸，以及非挥发性有机酸中的乳酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、草酸和富马酸等共8 种有机酸，采用高通量测序技术对第5轮次堆积发酵堆体外、中、内层的微生物群落进行解析，并结合理化因子，探究发酵过程不同醅层微生物群落特征差异和动态变化及其与环境因子的相关性机制，以期为优质酱香型白酒堆积发酵过程调控提供借鉴和参考。

  由图2a可知，堆体不同醅层的环境和温度在15.75～21.05 ℃之间波动。随堆积时间的延长，堆体温度整体呈上涨的趋势，可能是由于堆积起始阶段，堆体受到低温环境影响，同时堆体中微生物产生物热较少，而堆积后期，堆体微生物代谢活跃，其生物热积累，导致堆体温度上升。由图2b可知，各醅层的酸度呈波动变化趋势。堆积5 d时，3 个醅层的酸度相较于3 d均出现明显上升，可能是由于翻堆后促进了

  Acetobacter等好氧微生物的代谢，产生有机酸。堆体的水分质量分数在45.46%～46.31%之间波动变化，整体呈上涨的趋势（图2c）。堆体的还原糖质量分数整体呈上涨的趋势，而淀粉质量分数呈下降趋势（图2d、e），可能是由于淀粉逐渐降解为还原糖，在堆积结束时堆体还原糖含量降低，推测堆体中部分还原糖通过美拉德反应转化为吡嗪、糠醛等化合物。在堆积过程中，不同醅层之间温度具有非常明显差异（P＜0.05）。堆积0～1 d时堆体外层温度不高于中层和内层，堆积5～7 d时外层和中层温度高度明显高于内层（P＜0.001），可能是由于堆积后期，翻堆后堆体中溶氧量增加，主要促进了外层和中层的微生物活动，堆体生物热增加，同时堆体内部产生的热量向堆体表面聚集。酸度在3 个醅层之间均有显著差异（P＜0.05），堆积结束时（第7天），外层酸度高度明显低于中层和内层（P＜0.001），推测堆体内部产酸菌较为活跃，同时外层温度比较高，部分酸性化合物易于挥发。堆体3 个醅层的水分质量分数仅在堆积开始（0 d）具有高度显著差异。3 个醅层的还原糖质量分数在堆积过程中都具有极显著差异（P＜0.01）。3 个醅层的淀粉质量分数在堆积开始和堆积结束时具有非常明显差异（P＜0.05）。根据结果得出，不同醅层的理化因子呈阶段性差异特征。

  本实验通过HPLC技术对不同堆积时间和醅层的酒醅样本做检测，共定性定量8 种有机酸，分别为乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、草酸和富马酸，它们能消除白酒的糙辣感，增加醇厚感，同时会影响酒醅微生态，是堆积发酵的重要环境因子，因此，研究有机酸变化规律对酱香型白酒堆积发酵具备极其重大意义。由图3可知，在本研究检测到的有机酸中，乳酸含量最高，各醅层平均含量为34.910 mg/g，堆积5 d时内醅层的乳酸含量达到最高，为43.916 mg/g；其次为甲酸、乙酸、琥珀酸和苹果酸，各醅层平均含量分别为5.370、4.910、3.540、1.577 mg/g。其中，乳酸、乙酸和琥珀酸的含量与前人研究结果一致，可推测乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、苹果酸为第5轮次堆积发酵过程的主体有机酸。堆积5 d时，柠檬酸、草酸在各醅层的平均含量分别为1.209、0.130 mg/g。整个堆积过程中，3 个醅层富马酸的含量均低于0.013 mg/g。随着堆积的进行，堆体中乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、草酸含量整体呈上涨的趋势，在堆积5～7 d达到最高值。这可能是由于翻堆后堆体溶氧量增加，促进了微生物的生命活动（包括产酸菌的繁殖与代谢），促进了有机酸的积累。随堆积的进行，富马酸含量整体呈下降趋势。堆积0～3 d，乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸的含量在各醅层中无显著差异。在堆积1 d时，苹果酸、柠檬酸、草酸在堆体外层的含量高于中层和内层，可能是由于外层环境适宜酵母菌和霉菌等好氧微生物的生长和代谢，这些菌群通过三羧酸循环和乙醛酸循环生成苹果酸、柠檬酸和草酸。堆积5～7 d，除富马酸外，其余7 种有机酸均在各醅层中具有非常明显差异（

  P＜0.05）。其中，内层的有机酸含量高于外层和中层，推测翻堆后促进了内层LactobacillusAcetobacter等产酸微生物的代谢，且外层温度比较高，使部分有机酸挥发。

  在堆积过程中酒醅会富集来自大曲和环境中的微生物，导致其微生态发生复杂的变化，因此，研究酒醅微生物群落结构特征和演替规律，对进一步探究酱香型白酒堆积酒醅微生态具备极其重大意义。利用Illumina MiSeq测序技术平台对第5轮次堆积酒醅微生物做多元化的分析，结果如图4所示。

  本研究各醅层共检出了细菌门28 种、细菌属640 种、线 d），堆体各醅层中相对丰度排名前5的细菌属共有9 种，且均为各醅层的优势细菌属（相对丰度＞1%）。其中

  Kroppenstedtia和枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）是3 个醅层共有的细菌属，其平均相对丰度分别为26.16%和18.08%，可推测为堆积前期的主导细菌属。在堆积中后期（3～7 d），堆体3 个醅层相对丰度排名前5的细菌属种类一致，均为KroppenstedtiaAcetobacter、高温放线菌属（ThermoactinomycesVirgibacillusBacillus，其平均相对丰度分别为24.96%、20.08%、14.70%、12.01%、6.36%，且均为各醅层的优势细菌属（相对丰度＞1%），可推测为堆积中后期的主导细菌属。随着堆积的进行，堆体中各醅层的细菌属呈现趋同现象，其中KroppenstedtiaVirgibacillus在整个堆积过程中均为优势细菌属，是整个堆积过程中的主导细菌属，驱动堆积发酵的进行。Kroppenstedtia在各醅层整个堆积过程中的平均相对丰度为25.56%，且在堆积后期（5～7 d），Kroppenstedtia在内层的相对丰度高于外层和中层，这与王玉荣等的研究结果一致。Virgibacillus随着堆积的进行在外层和中层的相对丰度降低，外层下降幅度最大，由33.62%降至5.29%，而内层相对丰度在14.05%～7.61%之间波动，可能是由于在堆积后期堆体外层和中层的温度高于内层，其耐热性较弱。Acetobacter可代谢产生乙酸，并与乙醇等物质结合形成乙酸乙酯、乙酸异戊酯等风味物质，是白酒酿造的重要微生物。Acetobacter在0 d时相对丰度＜1%，随着堆积的进行，特别是在翻堆后各醅层的相对丰度均显著增加，7 d时在中层达到最高相对丰度，推测Acetobacter是第5轮次堆积发酵过程主要富集的细菌属。在堆积0 d时，各醅层的Lactobacillus平均相对丰度均大于7.00%，堆积中后期（3～7 d），其平均相对丰度降至1.20%，这与王源等的研究结果不一致，其具体机制有待进一步研究。

  由图4b可知，堆积前期（0～1 d），堆体各醅层中相对丰度排名前5的线 种，且都为各醅层的优势线%）。其中复膜孢酵母属（

  Saccharomycopsis）、嗜热真菌属（ThermomycesAspergillus、嗜热子囊菌属（Thermoascus）是3 个醅层共有的真菌属，平均相对丰度分别41.75%、24.14%、13.53%、10.11%，可推测为前期堆积发酵的主导线 个醅层相对丰度排名前5的线 种，且均为各醅层的优势线%），其中Pichia是3 个醅层共有的线 个醅层相对丰度排名前3的真菌属种类一致，均为哈萨克斯坦酵母属（KazachstaniaPichia和接合酵母属（Zygosaccharomyces），可推测这3 种菌属为中后期堆积发酵的主导真菌属，它们在堆积中后期的平均相对丰度分别为30.84%、19.51%和15.26%。各醅层SaccharomycopsisThermomycesThermoascus的相对丰度在整个堆积过程中均呈现下降趋势，这与陈卓等的研究结果一致，其中Saccharomycopsis下降幅度最大，到堆积后期在各醅层的平均相对丰度由41.75%下降至3.01%，这可能是由于堆积后期堆体温度急剧升高，它的耐热性较弱。KazachstaniaPichiaZygosaccharomyces在堆体各醅层的相对丰度均呈现上升趋势，可能是由于它们都具有一定的耐热性和耐酸性。其中，Kazachstania上升幅度最大，平均相对丰度由0.08%上升至37.00%，它能够与Lactobacillus共同产生乙醇；Pichia次之，平均相对丰度由1.06%上升至22.40%，它主要产乙醇和酯类物质，是白酒酿造的基本功能菌。

  以上根据结果得出，酱香型酒醅堆积初期菌群以大曲中的优势微生物为主，堆积前期和后期的主导真菌属相较于细菌属差异较大，推测随着堆积的进行，真菌群落变化大于细菌群落，堆体中主要富集了环境中的酵母菌等耐酸耐热微生物，丰富了窖池的微生物群落结构。

  为对比不同堆积时间和不同醅层的微生物差异，利用多级物种差异判别分析方法——线性判别分析效应值（LEfSe）分析确定不同时期中不同醅层的显著差异微生物（LDA得分＞3.50，

  P＜0.05）和极显著差异微生物（LDA得分＞3.50，P＜0.01），结果如图5所示。并且进一步分析了堆积过程中极显著差异微生物在不同醅层中的变化，结果如图6所示。

  由图5a～c可知，在堆积的3 个时期，醅层间显著差异细菌属共19 种，其中极显著差异细菌属共6 种，堆积前期有3 种，分别为嗜糖假单胞菌属（

  Pelomonas）、未分类的伪诺卡氏菌科（norank_f__Pseudonocardiaceae）和糖多孢菌属（Saccharopolyspora）；堆积中期无极显著差异细菌属；堆积后期有4 种极显著差异细菌属，分别为Pelomonas、杜擀氏菌属（Duganella）、厌氧杆菌属（Anaerosalibacter）和芽单胞菌属（Blastomonas）。Pelomonas是堆积发酵前期和后期的极显著差异细菌属，在整个堆积过程中，堆体中层Pelomonas的相对丰度都高于外层和内层，特别是堆积后期，可能由于Pelomonas是需氧菌，同时其耐热性较弱，中层环境更适宜生长。Pelomonas可通过代谢产酶促进脂肪酸的合成，从而提升酱香型白酒的风味品质。由图6a可知，堆体中层的Saccharopolyspora和norank_f__Pseudonocardiacea在堆积前中期（0～3 d）时相对丰度均低于外层和内层，在堆积后期（5～7 d）其相对丰度降低，且醅层间相对丰度趋同，可能是由于它们同属于伪诺卡氏菌科（Pseudonocardiaceae），在生长特性和功能上具有一定的相似性。Saccharopolyspora和norank_f__Pseudonocardiaceae均是堆积酒醅的优势细菌属（平均相对丰度＞1%），Saccharopolyspora与白酒中酱香、焦香等复杂风味形成有关，但norank_f__Pseudonocardiaceae在酒醅中的具体作用和功能有待进一步深入的研究。堆积后期（5～7 d），DuganellaBlastomonas在堆体中层的相对丰度高于外层和内层，Anaerosalibacter在堆体内层的丰度明显高于外层和内层，还需进一步深入探讨它们在酒醅微生物群落中的生态作用，以及它们对白酒风味和品质的贡献。

  由图5d～f可知，3 个堆积时期醅层间显著差异线 种，其中堆积前期极显著差异线 种，分别为拟青霉属（

  PaecilomycesSaccharomycopsisThermoascusCandida、双足囊菌属（Dipodascaceae_gen_Incertae_sedis）、节担菌属（Wallemia）和Aspergillus；堆积中期无极显著差异真菌属；堆积后期极显著差异线 种，分别为SaccharomycopsisPaecilomycesSaccharomycopsisPaecilomyces在酒醅发酵过程中主要参与淀粉的糖化和发酵过程，有助于降解酒醅中的淀粉和其他大分子物质，生成酸、醇、酯及芳香族化合物等众多风味物质。Paecilomyces在整个堆积过程中的平均相对丰度为2.30%（相对丰度＞1%），且在堆积3 d的堆体内层达到最高相对丰度，为14.81%。由此可见，SaccharomycopsisPaecilomyces是堆积发酵前期和后期的极显著差异真菌属，也是白酒酿造微生物中常见的优势真菌属，在堆积发酵过程中具有必不可少的作用。由图6b可知，堆积前期（0～1 d），CandidaSaccharomycopsis、Dipodascaceae_gen_Incertae_sedis在堆体中层的相对丰度高于外层和内层；WallemiaAspergillus在堆体内层的相对丰度高于外层和中层。Candida在酒醅和大曲中均有检出，具有生香作用；Aspergillus能够代谢产生多种有机酸，包括乳酸、琥珀酸、柠檬酸等，对白酒呈味具备极其重大影响，它们都是堆积酒醅中重要的微生物。堆积后期（5～7 d），Saccharomycopsis在内层的相对丰度高于外层和中层。通过LEfSe分析发现，随着堆积发酵进行，堆体3 个醅层的差异细菌属和差异真菌属种类减少，推测主要是翻堆后环境因子的改变所导致。

  在酱香型白酒堆积过程中，外因会影响微生物群落的生命活动，不同醅层具有不一样的环境因子。本研究通过Mantel test对酒醅微生物群落整体结构与环境因子的相关性做多元化的分析。由图7可知，还原糖、淀粉与第5轮次堆体3 个醅层的细菌群落和真菌群落呈现极显著相关（

  P＜0.01），推测它们是第5轮次堆体微生物群落的关键环境因子。为进一步研究环境因子与微生物的相互作用关系，本研究将整个堆积过程中平均相对丰度前10的微生物和极显著差异微生物作为关键微生物，在不同醅层中将关键微生物与环境因子进行Spearman相关性分析，评估它们之间的关系，结果如图8所示。

  由图8a～c可知，淀粉含量与堆体外层、中层和内层中关键细菌属的相关性大于其他理化因子。其中3 个醅层的淀粉含量均与

  Saccharopolyspora和norank_f__Pseudonocardiaceae呈高度显著正相关（P＜0.001），均与Acetobacter呈高度显著负相关（P＜0.001），可能是由于Acetobacter的碳源主要为淀粉降解后的还原糖；淀粉在3 个醅层都与Lactobacillus呈正相关，在堆积外层呈高度显著正相关（P＜0.001），推测Lactobacillus在淀粉含量较高的环境中具有优势。乳酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸和乙酸在堆体外层与多数关键细菌属呈正相关，其中苹果酸与LactobacillusStaphylococcus、norank_f__Pseudonocardiaceae、Saccharopolyspora呈极显著正相关（P＜0.01），推测除Lactobacillus产酸外，其余细菌属也有一定的产酸能力。在堆体中层，富马酸、琥珀酸与关键细菌属的相关性较强，其中富马酸与Acetobacter呈高度显著负相关（P＜0.001），琥珀酸与norank_f__Pseudonocardiaceae呈高度显著负相关（P＜0.001）。在堆体内层，甲酸与细菌属的相关性较强，与Staphylococcus、norank_f__Pseudonocardiaceae、Saccharopolyspora呈高度显著负相关（P＜0.001），与Acetobacter呈高度显著正相关（P＜0.001）。结果显示，淀粉与5 个关键细菌属呈现高度显著相关（P＜0.001），甲酸与4 个关键细菌属呈现高度显著相关（P＜0.001），相较于别的环境因子，它们与第5轮次堆体中的关键细菌属呈现相关性较强，推测淀粉与甲酸为堆积过程中细菌属的关键影响因子。

  由图8d可知，在堆体外层，还原糖和淀粉与关键真菌属的相关性强于其他理化因子。在堆体中层和内层，淀粉与关键真菌属的相关性强于其他理化因子（图8e、f）。其中，淀粉在3 个醅层都与

  Thermomyces呈高度显著正相关（P＜0.001），这与王玉荣等的研究结果一致；淀粉在3 个醅层都与Kazachstania呈极显著负相关（P＜0.01），可能是由于Kazachstania能利用淀粉转化的还原糖等物质，进而生成白酒中重要的风味物质。3 个醅层的Pichia均与还原糖呈极显著正相关（P＜0.01），它能利用还原糖进行生长和代谢。在堆体外层，苹果酸与关键真菌属的相关性强于其余有机酸，其中苹果酸与Aspergillus、Dipodascaceae_gen_Incertae_sedisSaccharomycopsis呈高度显著正相关（P＜0.001）。在堆体中层，琥珀酸与KazachstaniaSaccharomycopsisWallemia呈高度显著相关（P＜0.001），富马酸与KazachstaniaAspergillusThermomyces呈高度显著相关（P＜0.001），它们与关键真菌属的相关性大于其他有机酸。乳酸和甲酸分别与堆体内层中的6 个关键真菌属呈高度显著相关（P＜0.001），它们与关键真菌属的相关性大于其他有机酸。结果显示，淀粉和还原糖分别与7 种关键真菌属呈高度显著相关（P＜0.001），乳酸和甲酸分别与6 个关键真菌属呈高度显著相关（P＜0.001），推测它们为堆积过程中真菌属的关键影响因子。结合Mantel test分析发现，淀粉、还原糖、甲酸和乳酸是第5轮次堆积酒醅微生物的关键影响因子。此外，相较于关键细菌属，与环境因子具有较强相关性的关键真菌属种类更多，由此推测在本轮次堆积发酵过程中，真菌群落结构更容易受到环境因子的影响，其具体作用机制有待进一步研究。同时，环境因子在中醅层与关键微生物的相关性较弱，推测中醅层微生态环境较稳定。

  本研究聚焦第5轮次酱香型白酒堆积发酵过程酒醅，分析了理化因子、有机酸含量、微生物群落结构在不同堆积时间与不同醅层的变化规律及其相关性。结果显示，在堆积过程中，温度与酸度均在各醅层间具有非常明显差异（

  P＜0.05），在堆积结束时，堆体外层温度高度明显高于中层和内层（P＜0.001）；外层酸度高度明显低于中层和内层（P＜0.001）。堆体的淀粉质量分数整体呈现下降趋势，还原糖质量分数整体呈现上升趋势。第5轮次酒醅检测出的8 种有机酸中，乳酸含量最高，各醅层平均含量为34.910 mg/g，其次为甲酸、乙酸和琥珀酸。在堆积后期，除富马酸外，其余7 种有机酸均在各醅层中具有非常明显差异（P＜0.05）。通过扩增子测序技术，在第5轮次堆积酒醅中检测出640 种细菌属与187 种真菌属，其中KroppenstedtiaVirgibacillus是堆积前期的主导细菌属，KroppenstedtiaAcetobacterThermoactinomycesVirgibacillusBacillus是堆积中后期的主导细菌属。SaccharomycopsisThermomycesAspergillusThermoascus是堆积前期的主导真菌属，KazachstaniaPichiaZygosaccharomyces是堆积中后期的主导真菌属。堆积过程在醅层间共存在6 种极显著差异细菌属与7 种极显著差异真菌属。随着堆积的进行，真菌群落变化大于细菌群落。相关性分析表明，淀粉、还原糖、乳酸和甲酸含量与LactobacillusKazachstania等关键微生物具有较强相关性，它们是堆积酒醅微生物的关键环境因子，但是，在不同醅层中，与环境因子具有较强相关性的关键真菌属种类更多，推测在第5轮次堆积发酵过程中，真菌群落结构可能更容易受到环境因子的影响。今后，还需深入解析酱香型白酒堆积发酵过程中酒醅微生物与有机酸的相互作用机制，为酱香型白酒堆积发酵优化调控提供理论基础。

  明红梅，四川轻化工大学生物工程学院教授，硕士，硕士研究生导师。长期从事食品发酵技术、酿酒微生物资源开发与利用、发酵副产物综合利用方向的研究。主持四川省科技厅白酒产业转型升级重点研发等项目20余项；发表学术论文90余篇；授权发明专利2 项；完成5 项新产品研发并推广应用；先后为多家公司进行产品质量提高、关键技术攻关等方面的科技服务。